ריצוף סנגר (Dideoxy Sequencing):

• עיקרון השיטה:
  • פותחה בשנות ה-70 ומבוססת על שימוש בנוקלאוטידים מסוג ddNTPs (Dideoxyribonucleoside triphosphates).
  • נוקלאוטידים אלו מחוסרי קבוצת הידרוקסיל (3'-OH) הנדרשת ליצירת קשר פוספודיאסטרי.
  • כאשר דנ"א פולימראז מכניס ddNTP לגדיל הנבנה, השרשרת נעצרת ולא ניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים.
• ריצוף ידני (השיטה הישנה):
  • הריאקציה מחולקת ל-4 מבחנות שונות, כאשר בכל אחת יש תבנית DNA, פריימר, פולימראז, תערובת של dNTPs רגילים ומעט ddNTP מסוג אחד בלבד (A, T, C או G).
  • התהליך מייצר מקטעים באורכים שונים המסתיימים באותו נוקלאוטיד.
  • התוצרים מורצים על ג'ל אלקטרופורזה ארוך מאוד (כמטר) ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד, וקוראים את הרצף מלמטה (המקטעים הקצרים ביותר) למעלה.
• ריצוף אוטומטי (מודרני יותר):
  • מתבצע במבחנה אחת בלבד.
  • כל סוג של ddNTP מסומן בצבע פלואורסצנטי שונה (למשל A בירוק, C בכחול).
  • ההרצה מתבצעת בקפילרה במקום בג'ל רחב, וגלאי אופטי קורא את הצבעים לפי סדר הגודל של המקטעים.

ריצוף גנומים שלמים (Whole Genome Sequencing):

• שיטת ה-Shotgun Sequencing:
  • הגנום נחתך למקטעים קטנים באמצעות אנזימי רסטריקציה, ואלה מוכנסים לתוך פלסמיד כדי ליצור "ספרייה גנומית".
  • היתרון בשימוש בפלסמידים הוא היכולת להשתמש בפריימר אוניברסלי אחד שמתיישב על הפלסמיד וקורא לתוך ה-Insert, ללא צורך לדעת את רצף המטרה מראש.
  • לאחר ריצוף המקטעים, משתמשים בכלים ביואינפורמטיים (כמו BLAST) כדי למצוא חפיפות (Overlaps) ולבצע "תפירה" של הרצפים לגנום שלם.
• התמודדות עם אזורים חוזרניים (Repetitive DNA):
  • דנ"א חוזרני (כמו רצפי CAG במחלת ההנטינגטון) מקשה על חיבור המקטעים כי קשה למקם אותם נכון.
  • הפתרון היה שימוש ב-BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) - וקטורים שמסוגלים להכיל מקטעי ענק , כך שהרצף החוזרני נבלע בתוך מקטע ארוך שניתן לקרוא את קצותיו בבירור.

הדור הבא של הריצוף (Next Generation Sequencing - NGS):

• מאפייני השיטה:
  • הוזלה משמעותית ומהירות עצומה תודות לריצוף מקביל וסימולטני של מיליוני מולקולות.
  • בניגוד לסנגר, ההגברה (PCR) נעשית על גבי תמיכה מוצקה (שבב או כדורית) ולא בנוזל.
• מערכת Illumina (Sequencing by Synthesis):
  • מוסיפים אדפטורים (Linkers) לקצות מולקולות הדנ"א, והם נקשרים לרצפים משלימים על פני השבב.
  • הגברה קלונלית (Bridge Amplification): כל מולקולה עוברת PCR מקומי כך שנוצר אשכול (Cluster) של מולקולות זהות. זה הכרחי כדי לקבל סיגנל פלואורסצנטי חזק מספיק למצלמה.
  • תהליך הריצוף: שימוש בנוקלאוטידים מהונדסים בעלי סמן פלואורסצנטי וקבוצה חוסמת הפיכה בקצה ה-3'-OH.
  • בכל מחזור נכנס נוקלאוטיד אחד, השבב מצולם, ולאחר מכן החוסם והצבע נשטפים כימית כדי לאפשר את כניסת הנוקלאוטיד הבא בסייקל.
• מערכת Ion Torrent:
  • עובדת על זיהוי שינויים ב-pH (שחרור פרוטונים - H+) המתרחשים באופן טבעי כאשר DNA פולימראז יוצר קשר פוספודיאסטרי.
  • כל מקטע דנ"א מוגבר על גבי מיקרו-כדורית (Bead) הנמצאת בתוך באר זעירה בשבב.
  • בכל פעם מזרימים רק סוג אחד של נוקלאוטיד רגיל (למשל רק A). אם נוצר קשר, משתחרר פרוטון והחיישן מתעד קפיצה ב-pH. גובה הפיק מצביע על כמות הנוקלאוטידים הזהים שנכנסו ברצף.

ריצוף רנ"א (RNA-seq) וריצוף תאים בודדים (scRNA-seq):

• ריצוף Bulk RNA-seq:
  • כדי לרצף רנ"א, קודם כל הופכים אותו לדנ"א משלים (cDNA) באמצעות האנזים Reverse Transcriptase.
  • החיסרון בטחינת רקמה שלמה (כמו מוח) הוא אובדן המידע לגבי התא המקורי שממנו הגיע הרנ"א ואובדן המידע המרחבי.
• ריצוף Single-Cell RNA-seq:
  • שיטה המפרידה את התאים לפני פירוקם.
  • מערכות מכניסות כל תא לתוך בועית שמן (GEM) יחד עם "ברקוד" - רצף נוקלאוטידים ייחודי ואנזימים.
  • לאחר יצירת ה-cDNA בבועיות, כל מולקולה מסומנת בברקוד של התא. אז ניתן לפרק את הבועיות, לערבב הכל יחד ולשלוח לריצוף (Illumina).
  • הברקוד מאפשר לשייך כל טרנסקריפט חזרה לתא הספציפי שייצר אותו ולהבדיל בין סוגי תאים (נוירונים, אסטרוציטים וכו').
• ריצוף Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-seq):
  • מיועד לרקמות קפואות בהן התאים נהרסו בתהליך ההפשרה. מתבסס על ריצוף הרנ"א שנמצא בתוך הגרעין (חלקו טרם עבר עיבוד) והשוואתו לטרנסקריפטום הכללי.

ריצוף מרחבי באתרו - Expansion Sequencing (ExSeq):

• פתרון אובדן המידע המרחבי:
  • גם ב-Single Cell אנו מאבדים את המידע לגבי מיקומו הפיזי של התא ברקמה והקשר שלו לתאים סמוכים.
• מנגנון ה-Expansion:
  • שילוב של מיקרוסקופיה מתקדמת וריצוף ישירות על גבי הרקמה השלמה.
  • החדרת פולימר סופח מים (Sodium polyacrylate) לתוך הרקמה. לאחר הוספת מים, הרקמה תופחת ומתרחבת עד פי 10, תוך שמירה מושלמת על הפרופורציות המרחביות שלה (ללא עיוות).
  • ההרחבה מאפשרת להתגבר על מגבלת הרזולוציה של המיקרוסקופ ולרצף מולקולות רנ"א בודדות ישירות בתוך הקשרן המרחבי (למשל, האם רנ"א מסוים מתבטא ליד הסינפסה או בגרעין).
• יישום קליני באורגנואידים:
  • שימוש באורגנואידים (מודלים תלת-ממדיים דמויי-מוח שנוצרו מתאי גזע מושרים - iPSCs) לחקר מחלות נוירו-התפתחותיות (כמו מוטציה ב-STXBP1).
  • באמצעות המערכת ניתן לסרוק את האורגנואיד השלם במיקרוסקופ קונפוקלי ולזהות ביטוי דיפרנציאלי של גנים בין תאים בריאים לחולים ברזולוציה תת-תאית (למשל, שלוחות אקסונים ודנדריטים לעומת גופי תא).